LAFORINA

Project Title
Protein-Carbohydrate interaction characterization of Laforina - A human protein involved in lafora Disease
Project Type
Nacional / Public
Funding Body
Funding Program
COMPETE
Reference
PTDC/BIA-PRO/111141/2009
Funding
  • CEB: 27 660,00
  • Total: 185 528,00
Start
01-03-2011
End
28-02-2014
Partnership
BIOCANT - Associação de Transferência de Tecnologia, Centro de Neurociências e Biologia Celular (CNBC/UC), Universidade do Minho
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Principal Investigator

Team Members - CEB

Abstract

A laforina é uma fosfatase de dupla especificidade humana única, por conter um módulo de ligação a carbohidratos (CBM) no terminal amínico e um domínio de fosfatase no terminal carboxílico. Mutações da laforina foram associadas à doença de Lafora – epilepsia mioclónica fatal com aparecimento em idade precoce e transmissão autossómica recessiva. Esta doença é caracterizada por crises mioclónicas, deterioração neurológica cumulativa, e pelo aparecimento de agregados de glicogénio hiperfosforilado e pouca ramificação, chamados corpos de Lafora, no citoplasma de quase todos os tipos de células. A laforina está envolvida no metabolismo do glicogénio – a sua desfosforilação pela laforina, que é dependente da sua ligação pelo CBM, é responsável pela ramificação do glicogénio, mantendo-o numa forma solúvel. O CBM da laforina foi incluído na família CBM20 dos CBMs, apesar da baixa semelhança da sequência com os restantes membros da mesma família, principalmente pela conservação de três resíduos de triptofano (Trp), previstos se encontrarem no local de interacção com os carbohidratos. A actividade de ligação a carbohidratos do CBM da laforina tem sido pouco caracterizada, tendo apenas sido testada a sua ligação a carbohidratos insolúveis, e a maioria dos estudos avaliou essa ligação indirectamente, pela capacidade de inibição da actividade de fosfatase. Várias proteína interagem com a laforina, incluindo a subunidade reguladora 5 da proteína fosfatase (PP1), que actua como subunidade de direccionamento de glicogénio (PTG) para a PP1 e que regula a sua actividade. Esta proteína está também envolvida no metabolismo do glicogénio e tem um CBM putativo, cuja semelhança de sequência o coloca na família CBM21. Numa colaboração anterior, fomos, pela primeira vez, capazes de expressar e purificar quantidades significativas da laforina completa e do seu CBM. Neste projecto pretende-se realizar uma caracterização profunda da interacção laforina-carbohidrato. Para além disso pretende-se produzir e caracterizar o CBM da R5/PTG no sentido de clarificar a sua interacção com carbohidratos, com vista e uma possível aplicação biotecnológica destes CBMs humanos. O projecto começará pela produção de laforina, o seu CBM e o CBM da R5/PTG, e de seguida, por estudos de fluorescência intrínseca do Trp e espectros de absorção diferencial de UV avaliaremos as preferências de ligação a oligosacarídeos de tamanho crescente. De seguida, estas preferências serão validadas e as suas cinéticas de ligação determinadas por estudos de ressonância de plasma de superfície – uma técnica bastante indicada para avaliar interacções moleculares como a ligação proteína-carbohidrato. O projecto também irá focar-se na caracterização dos epítopos de ligação dos ligandos e nas suas conformações ligadas às proteínas por técnicas de Ressonância Magnética Nuclear (RMN). A técnica de Diferença de Transferência de Saturação (STD) é uma técnica muito poderosa – pela saturação dos sinais da proteína ela permite a determinação das partes do ligando em contacto directo com o local de ligação da proteína. O efeito de Overhauser nuclear transferido (tr-nOe) é outra técnica de RMN complementar que detecta as alterações causadas pela ligação do ligando do lado do oligosacarídeo na sua conformação ligada, e que pode dar mais alguma informação sobre a natureza química dos aminoácidos do CBM directamente envolvidos na ligação ao carbohidrato. A parte final do projecto focará na determinação da estrutura tridimensional do CBM da laforina em solução por RMN. Uma vez que os resíduos de Trp foram previstos como estando directamente envolvidos na ligação a carbohidratos, iremos produzir uma proteína com os Trp marcados que servirá não só para identificar os resíduos envolvidos na ligação por tr-nOe mas também irá ajudar à atribuição dos picos no espectro de RMN. A mesma estratégia será aplicada ao CBM da R5/PTM, uma vez que a sua ligação aos carbohidratos também deverá ser dependente de resíduos de Trp presentes no CBM. A compreensão de como a laforina interage com o glicogénio é um dos aspectos chave que necessita ser determinado para que se possam desenvolver novas estratégias para o tratamento da doença de Lafora, uma vez que neste momento não existe tratamento disponível. Este conhecimento, em conjunto com o que se descobrir sobre o mecanismo de ligação ao glicogénio do CBM da R5/PTG, será também importante na compreensão dos mecanismos de interacção com carbohidratos de outras proteínas que ocorrem em processos celulares muito importantes como a adesão celular, tráfico, apoptose e resposta imunitária. Este trabalho trará muito certamente novas visões para o uso biotecnológico da laforina e/ou dos CBMs da laforina e R5/PTG. Uma vez que a laforina e a R5/PTG são humanas, os seus CBMs são considerados como candidatos promissores para CBMs não imunogénicos para direccionamento de drogas, para além das outras aplicações mais comuns dos CBMs.